Regulación alostérica de la AHAS
La reacción llevada a cabo por la AHAS es la primera
reacción común en la biosíntesis de los tres aminoácidos ramificados en
plantas, algas, hongos y bacterias, y por tanto está sometida a
retroalimentación negativa por parte productos terminales de la ruta
metabólica. En procariotas el efector es normalmente valina, aunque también
pueden tener algún efecto la leucina y la isoleucina. Las AHAS de bacterias han
sido estudiadas en profundidad, particularmente la de E. coli que codifica para tres isoenzimas diferentes (AHAS I, AHAS
II y AHAS III), con diferentes propiedades y respuestas regulatorias. Muchas
otras bacterias presentan una única AHAS con una subunidad reguladora similar a
la de AHAS III y por tanto un similar modelo de inhibición mixta no cooperativa
por valina. La inhibición por valina es un obstáculo en el uso de fermentadores
para la sobreproducción de la misma valina o antibióticos que contengan valina.
Por tanto, muchas líneas de investigación están interesadas en explotar la
manipulación genética para obtener cepas resistentes a la inhibición por valina
para evitar este problema. En las enterobacterias codificadoras de las tres
isoenzimas se observa una resistencia a esta inhibición por valina ya que la
AHAS II no se ve inhibida por este aminoácido.
AHAS III bacteriana
La inhibición por valina de la AHAS III no es completa y
alcanza una saturación al 60-85%. Los estudios cinéticos de esta enzima a
distintas concentraciones de piruvato y de valina indican que el modelo de
inhibición es mixto no cooperativo, es decir, una inhibición básicamente no
competitiva. La localidad del sitio para la valina en AHAS III ha sido
estudiada por mutagénesis. La mayoría de las mutaciones espontáneas que
confieren resistencia a la inhibición por valina en la AHAS III que han sido
descritas son consistentes con el hecho de que la valina establece contactos en
el dominio ACT. Estos dominios están presentes en todas las subunidades
reguladoras estudiadas están formados por una motivo que adopta una topología
beta-alfa-beta-beta-alfa-beta. Posteriormente se han desarrollado mutantes de
esta enzima resistentes a valina modificando residuos en este dominio.
Una observación interesante es que el mutante Thr34Cys tiene
poco efecto en la respuesta a valina, mientras que el reemplazo de la treonina por
un aminoácido voluminoso incrementa el equilibrio de inhibición unas 50 veces. La
treonina 34 no es el lugar en el que se cree que se une la valina, sino que su
papel en la inhibición se basa en su involucración en distintos dominios o en las
interacciones entre subunidades.
Aunque el sitio de unión a la valina se encuentra en el dominio N-terminal, el dominio C-terminal también se requiere para la inhibición por valina. De este modo, las enzimas mutantes truncadas o con mutaciones puntuales en el dominio C-terminal mantienen su actividad pero pierden completamente la sensibilidad a la valina. No se conoce con certeza qué regiones del dominio C-terminal se requieren para que el péptido confiera sensibilidad a la valina o cómo duncionan los dominios de la subunidad reguladora. Se llevaron a cabo estudios de mutagénesis aleatoria masiva en el dominio C-terminal acoplada a reconstitución in vivo y a la selección para aislar mutantes resistentes a valina. Los mutantes truncados así como un mutante puntual, obtenidos en el experimento sintetizaban una proteína a cuyo dominio ACT no se unía la valina de manera estable. Esto indica que las interacciones del dominio ACT con un dominio C-terminal normal e intacto son necesarias para que el dominio ACT alcance la conformación necesaria con alta afinidad por valina.
La subunidad reguladora de la AHAS I es una proteína corta de 96 aminoácidos (aproximadamente la mitad que la subunidad reguladora de AHAS III y otras AHAS bacterianas), la cual parece ser que se pliega para formar único dominio similar al ACT. La AHAS I muestra una respuesta de inhibición ante valina con muy poca actividad residual cuando se alcanza la saturación, lo cual permite encajar esta regulación en el modelo alostérico exclusivo clásico de Monod-Wyman-Changeux (MWC). Este modelo asume la creación de un equilibrio de forma cooperativa de todas las subunidades simultáneamente entre dos estados conformacionales, uno de los cuales tiene alta afinidad por el sustrato y otro de los cuales tiene una alta afinidad por el inhibidor además de excluir al sustrato. Estudios de mutantes han corroborado que el sitio de unión de la valina para esta enzima es también el dominio ATC.
La AHAS II no es sensible a la retroregulación negativa por cualquier aminoácido y no muestra sitio de unión a la valina. Un examen de su secuencia muestra que esta no muestra homología estructural con los dominios ATC y que le faltan varios de los elementos de unión a ligando necesarios para la unión del aminoácido. Por ejemplo, la G14 de AHAS III o la G20 de AHAS I son reemplazadas por glutamato, y la N11 de la AHAS III o la N17 de la AHAS I son reemplazadas por una fenilalanina.
La subunidad reguladora de la AHAS de plantas es considerablemente más grande que la subunidad reguladora de la AHAS III de E. coli, y por tanto su comportamiento regulador es más complejo. La holoenzima en su conjunto no puede ser aislada directamente de tejido vegetal o de cultivos de tejidos, pero la mezcla de la subunidad catalítica purificada a partir de A. thaliana con su subunidad reguladora obtenida por expresión recombinante permite obtener una holoenzima activa que es sensible a inhibición por valina, leucina e isoleucina. Existe una sinergia entre los efectos de la leucina y la valina en la enzima reconstituida que imita de forma muy cercana la actividad de la enzima en los extractos de muestra vegetal.
La subunidad reguladora contiene una secuencia de aproximadamente 180 residuos y ha sido propuesto que contiene dos dominios correspondientes a dos repeticiones de dominios similares a ACT, que presentan sitios de unión separados para leucina y para valina/isoleucina en la interfaz del dominio. Cuando cualquiera de los sitios se ocupa con un ligando, se produce una señal en un centro común de la subunidad que induce la inhibición de la actividad catalítica. Además, se ha sugerido que otras señales separadas y recíprocas que facilitan la unión del otro regulador cuando uno ya está unido. Las hipótesis sobre este centro común se basan en la observación de que la intensidad de la inhibición es similar cuando solo se une leucina y cuando se une la combinación de leucina y valina.
Las AHAS de levadura y otros hongos son únicas ya que su inhibición por valina es completamente anulada en presencia de MgATP. MgATP produce una pequeña activación de la enzima incluso en ausencia de valina. La subunidad reguladora de la AHAS fúngica tiene una secuencia conservada de 140-150 aminoácidos, similar a la que se repite en la AHAS vegetal, con un inserto de 38-55 aminoácidos que está parcialmente conservado entre las AHAS de hongos. El comportamiento cinético de la AHAS de levadura podría ser interpretado usando un modelo alostérico clásico, en el que la subunidad reguladora existe en dos conformaciones, H y L. Estas conformaciones están en equilibrio con respecto a la otra. Ambas se unen con la misma afinidad a la subunidad catalítica, pero cual la conformación H está unida a esta subunidad da lugar a una estimulación sustancial (con un factor de 10) de su actividad. Mientras tanto, si es la conformación L la que se une a la subunidad catalítica, produce una pequeña o nula estimulación. El MgATP se une a la conformación H y en condiciones de saturación convertirá todas las subunidades reguladoras a la conformación H. Para la subunidad reguladora no mutada, la constante de equilibrio es de aproximadamente 0,2, por lo que en la ausencia de MgATP la conformación H está favorecida respecto a la L en una relación 5:1, por lo que el efecto del MgATP en la enzima no inhibida es pequeño. La valina se une a la conformación L y por tanto inhibe a la enzima debido a la disminución de la proporción de la conformación H. En presencia de valina, el MgATP tiene una gran actividad al ser capaz de cambiar drásticamente el balance entre H y L hacia la conformación H.
Aunque el sitio de unión a la valina se encuentra en el dominio N-terminal, el dominio C-terminal también se requiere para la inhibición por valina. De este modo, las enzimas mutantes truncadas o con mutaciones puntuales en el dominio C-terminal mantienen su actividad pero pierden completamente la sensibilidad a la valina. No se conoce con certeza qué regiones del dominio C-terminal se requieren para que el péptido confiera sensibilidad a la valina o cómo duncionan los dominios de la subunidad reguladora. Se llevaron a cabo estudios de mutagénesis aleatoria masiva en el dominio C-terminal acoplada a reconstitución in vivo y a la selección para aislar mutantes resistentes a valina. Los mutantes truncados así como un mutante puntual, obtenidos en el experimento sintetizaban una proteína a cuyo dominio ACT no se unía la valina de manera estable. Esto indica que las interacciones del dominio ACT con un dominio C-terminal normal e intacto son necesarias para que el dominio ACT alcance la conformación necesaria con alta afinidad por valina.
AHAS I bacteriana
La subunidad reguladora de la AHAS I es una proteína corta de 96 aminoácidos (aproximadamente la mitad que la subunidad reguladora de AHAS III y otras AHAS bacterianas), la cual parece ser que se pliega para formar único dominio similar al ACT. La AHAS I muestra una respuesta de inhibición ante valina con muy poca actividad residual cuando se alcanza la saturación, lo cual permite encajar esta regulación en el modelo alostérico exclusivo clásico de Monod-Wyman-Changeux (MWC). Este modelo asume la creación de un equilibrio de forma cooperativa de todas las subunidades simultáneamente entre dos estados conformacionales, uno de los cuales tiene alta afinidad por el sustrato y otro de los cuales tiene una alta afinidad por el inhibidor además de excluir al sustrato. Estudios de mutantes han corroborado que el sitio de unión de la valina para esta enzima es también el dominio ATC.
AHAS II bacteriana
La AHAS II no es sensible a la retroregulación negativa por cualquier aminoácido y no muestra sitio de unión a la valina. Un examen de su secuencia muestra que esta no muestra homología estructural con los dominios ATC y que le faltan varios de los elementos de unión a ligando necesarios para la unión del aminoácido. Por ejemplo, la G14 de AHAS III o la G20 de AHAS I son reemplazadas por glutamato, y la N11 de la AHAS III o la N17 de la AHAS I son reemplazadas por una fenilalanina.
AHAS vegetal, de A. thaliana
La subunidad reguladora de la AHAS de plantas es considerablemente más grande que la subunidad reguladora de la AHAS III de E. coli, y por tanto su comportamiento regulador es más complejo. La holoenzima en su conjunto no puede ser aislada directamente de tejido vegetal o de cultivos de tejidos, pero la mezcla de la subunidad catalítica purificada a partir de A. thaliana con su subunidad reguladora obtenida por expresión recombinante permite obtener una holoenzima activa que es sensible a inhibición por valina, leucina e isoleucina. Existe una sinergia entre los efectos de la leucina y la valina en la enzima reconstituida que imita de forma muy cercana la actividad de la enzima en los extractos de muestra vegetal.
La subunidad reguladora contiene una secuencia de aproximadamente 180 residuos y ha sido propuesto que contiene dos dominios correspondientes a dos repeticiones de dominios similares a ACT, que presentan sitios de unión separados para leucina y para valina/isoleucina en la interfaz del dominio. Cuando cualquiera de los sitios se ocupa con un ligando, se produce una señal en un centro común de la subunidad que induce la inhibición de la actividad catalítica. Además, se ha sugerido que otras señales separadas y recíprocas que facilitan la unión del otro regulador cuando uno ya está unido. Las hipótesis sobre este centro común se basan en la observación de que la intensidad de la inhibición es similar cuando solo se une leucina y cuando se une la combinación de leucina y valina.
AHAS de levadura
Las AHAS de levadura y otros hongos son únicas ya que su inhibición por valina es completamente anulada en presencia de MgATP. MgATP produce una pequeña activación de la enzima incluso en ausencia de valina. La subunidad reguladora de la AHAS fúngica tiene una secuencia conservada de 140-150 aminoácidos, similar a la que se repite en la AHAS vegetal, con un inserto de 38-55 aminoácidos que está parcialmente conservado entre las AHAS de hongos. El comportamiento cinético de la AHAS de levadura podría ser interpretado usando un modelo alostérico clásico, en el que la subunidad reguladora existe en dos conformaciones, H y L. Estas conformaciones están en equilibrio con respecto a la otra. Ambas se unen con la misma afinidad a la subunidad catalítica, pero cual la conformación H está unida a esta subunidad da lugar a una estimulación sustancial (con un factor de 10) de su actividad. Mientras tanto, si es la conformación L la que se une a la subunidad catalítica, produce una pequeña o nula estimulación. El MgATP se une a la conformación H y en condiciones de saturación convertirá todas las subunidades reguladoras a la conformación H. Para la subunidad reguladora no mutada, la constante de equilibrio es de aproximadamente 0,2, por lo que en la ausencia de MgATP la conformación H está favorecida respecto a la L en una relación 5:1, por lo que el efecto del MgATP en la enzima no inhibida es pequeño. La valina se une a la conformación L y por tanto inhibe a la enzima debido a la disminución de la proporción de la conformación H. En presencia de valina, el MgATP tiene una gran actividad al ser capaz de cambiar drásticamente el balance entre H y L hacia la conformación H.
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