Mecanismo de acción de la AHAS
La mayoría de los datos estructurales y sobre el mecanismo enzimático de AHAS provienen de una sola isoenzima, la AHAS II de E. coli. Es importante señalar que esta enzima tiene varias propiedades atípicas. Sus subunidades reguladoras tienen diferencias importantes en su secuencia en comparación con las otras AHAS, no muestra retroregulación negativa y su subunidad catalítica no es activa por sí sola. La reacción secundaria que la AHAS lleva acabo para la formación de peracetato es al menor un orden de magnitud más rápida en la AHAS II que en la AHAS III.
La tiamina difosfato de la enzima juega un papel central en el mecanismo de acción. Una molécula de piruvato es atacada por el carbanión formado en la tiamina difosfato y sufre la consiguiente descarboxilación. En posteriores pasos, la hidroxietiltiamina difosfato (HEThDP) formada ataca al segundo carbonil sustratro (aceptor) para formar un aducto entre el producto de la catálisis y la tiamina fosfato. En los últimos pasos, el producto se disocia dela tiamina difosfato para separarse en su forma libre. La competición directa entre sustratos aceptores alternativos por la HEThDP formada es lo que determina la relación entre los productos que se forman.
En todas las enzimas dependientes de tiamina difosato, el cofactor ligado adquiere una conformación en V en el centro activo, dando lugar que el grupo amina del N4' se encuentre muy cercano al C2 del anillo tiazol. Además, el N1' es mantenido cerca de una cadena lateral de un glutamato conservado. Estudios con deuterio en enzimas dependientes de tiamina difosfato revelaron que tasa típica de intercambio protónico en el C2 de la tiamina difosfato se conseguía gracias a la formación de un puente consistente en el glutamato conservado, la porción aminopirimidina y el C2-H. Sin embargo, la mutación del glutamato conservado a glutamina o alanina resultó en una reducción de la tasa de desprotonación del C2 de solo dos órdenes.
En las enzimas no mutadas, la relación entre productos depende solamente de las cantidades relativas de los aceptores presentes en el medio. La constante catalítica de la enzima es casi independiente de la cantidad o la identidad de los aceptores, lo que indica que está determinada por pasos que preceden al paso de carboligación que determina el producto, de modo que los pasos que contribuyen a la discriminación de los aceptres tienen poco efecto en la tasa general de reacción.
En todas las enzimas dependientes de tiamina difosato, el cofactor ligado adquiere una conformación en V en el centro activo, dando lugar que el grupo amina del N4' se encuentre muy cercano al C2 del anillo tiazol. Además, el N1' es mantenido cerca de una cadena lateral de un glutamato conservado. Estudios con deuterio en enzimas dependientes de tiamina difosfato revelaron que tasa típica de intercambio protónico en el C2 de la tiamina difosfato se conseguía gracias a la formación de un puente consistente en el glutamato conservado, la porción aminopirimidina y el C2-H. Sin embargo, la mutación del glutamato conservado a glutamina o alanina resultó en una reducción de la tasa de desprotonación del C2 de solo dos órdenes.
Cinética de la enzima
En las enzimas no mutadas, la relación entre productos depende solamente de las cantidades relativas de los aceptores presentes en el medio. La constante catalítica de la enzima es casi independiente de la cantidad o la identidad de los aceptores, lo que indica que está determinada por pasos que preceden al paso de carboligación que determina el producto, de modo que los pasos que contribuyen a la discriminación de los aceptres tienen poco efecto en la tasa general de reacción.
Los comportamientos cinéticos de varias formas mutantes de AHAS II son completamente diferentes, Por ejemplo, la modificación de la Met260, la Phe109 o la Arg276 dan lugar que la reacción con el sustrato aceptor sea al menos parcialmente determinantes de la tasa de reacción. En las catálisis llevadas a cabo por estos mutantes, la reacción del HEThDP con el carbonil del segundo sustrato, la liberación del producto o ambos procesos son significativamente más lentos que en la enzima no mutada. Esto permite detectar cantidades significantes de intermediarios covalentes en el estado estacionario.
Intermediarios
Tanto el aducto de la tiamina difosfato con el grupo lactil (LThDP) previo a la descarboxilación del piruvato, como el HEThDP y el acetohidroxiácido producido producido pueden ser detectados cuantitativamente en la mezcla de reacción después de una rápida inactivación de la enzima. La determinación de la distribución de los intermediarios claves por análisis de RMN hace posible calcular las constantes para las tasas unimoleculares de reacción para los pasos individuales de la catálisis.
La tasa de formación para el LThDP, el primer paso detectable, es abrumadoramente determinante para la tasa general de la catálisis, mientras que los pasos posteriores (descarboxilación, carboligación y liberación del producto) tienen unas tasas mucho mayores y parecidas entre sí. Esta diferencia entre las tasas de reacción explican por qué la constante catalítica de la AHAS es esencialmente la misma para la formación de acetolactato o de acetohidroxibutirato, a pesar de que la preferencia de 2-cetobutirato como aceptor es 60 veces mayor que con el piruvato. La existencia de un paso cuya determinación de la velocidad de catálisis sea tan abrumadora es única para la AHAS, ya que en otras enzimas dependientes de tiamina difosfato las energías para todos los estados de transición son similares. El origen molecular para la lenta y determinante tasa de formación del LThDP es un importante puzzle a resolver en el mecanismo de la AHAS.
La formación determinante de LThDP tiene una interesante consecuencia para reacciones "no naturales" de la AHAS. Tanto la AHAS I como la AHAS II son capaces de catalizar la formación de fenilacetil carbinoles a partir de piruvato y de benzaldehído o sus derivados en competición con la formación de acetolactato y/o acetohidroxibutirato. Muchos mutantes de AHAS que se especializan en la formación de los acetohidroxiácidos frente a la formación de los fenilacetil carbinoles son tanto excelentes herramientas potenciales biosintéticas como fuentes de información para las interacciones enzima-sustrato en estas enzimas. Un grupo de residuos situados en el centro activo, particularmente una arginina, se requieren para una reacción rápida y específica del intermediario HEThDP con piruvato o cetobutirato, pero no con aldehídos aromáticos. Por ejemplo, la mutagénesis de la Arg276 en AHAS II da lugar a una enzima que puede sintetizar fenilacetil carbinoles tan rápidamente como la enzima no mutada sintetiza acetolactato o acetohidroxibutirato, además de mantener su estereoespecificidad.
Algunas de las AHAS presentan una significante reacción oxigenasa secundaria en la que el oxígeno molecular ataca electrofílicamente el carbanión altamente reactivo para formar un aducto peróxido que se descompone en tiamina difosfato y ácido peracético. El ácido peracético puede reaccionar posteriormente con piruvato para dar lugar a dos moléculas de acetato. Esta reacción oxigenasa está parcialmente inhibida por altas concentraciones de los cetoácidos aceptores, pero esta inhibición es saturable, manteniéndose una actividad oxigenasa residual del 10-15%. Por tanto, un mecanismo clásico de Theorell-Chance que involucre la expulsión de dióxido de carbono de forma simultánea con la reacción del aceptor puede ser descartado. Una alternativa es que el oxígeno podría rutas de acceso al sitio activo que son diferentes de las utilizadas por los sustratos aceptores. Recientes resultados con AHAS II han mostrado que hay una ruta adicional para el consumo de oxígeno a través de un ciclo fútil redox en el que el FAD es reducido por la forma reactiva de carbanión y reoxidado por el oxígeno molecular.
La tasa de formación para el LThDP, el primer paso detectable, es abrumadoramente determinante para la tasa general de la catálisis, mientras que los pasos posteriores (descarboxilación, carboligación y liberación del producto) tienen unas tasas mucho mayores y parecidas entre sí. Esta diferencia entre las tasas de reacción explican por qué la constante catalítica de la AHAS es esencialmente la misma para la formación de acetolactato o de acetohidroxibutirato, a pesar de que la preferencia de 2-cetobutirato como aceptor es 60 veces mayor que con el piruvato. La existencia de un paso cuya determinación de la velocidad de catálisis sea tan abrumadora es única para la AHAS, ya que en otras enzimas dependientes de tiamina difosfato las energías para todos los estados de transición son similares. El origen molecular para la lenta y determinante tasa de formación del LThDP es un importante puzzle a resolver en el mecanismo de la AHAS.
Sustratos no naturales
La formación determinante de LThDP tiene una interesante consecuencia para reacciones "no naturales" de la AHAS. Tanto la AHAS I como la AHAS II son capaces de catalizar la formación de fenilacetil carbinoles a partir de piruvato y de benzaldehído o sus derivados en competición con la formación de acetolactato y/o acetohidroxibutirato. Muchos mutantes de AHAS que se especializan en la formación de los acetohidroxiácidos frente a la formación de los fenilacetil carbinoles son tanto excelentes herramientas potenciales biosintéticas como fuentes de información para las interacciones enzima-sustrato en estas enzimas. Un grupo de residuos situados en el centro activo, particularmente una arginina, se requieren para una reacción rápida y específica del intermediario HEThDP con piruvato o cetobutirato, pero no con aldehídos aromáticos. Por ejemplo, la mutagénesis de la Arg276 en AHAS II da lugar a una enzima que puede sintetizar fenilacetil carbinoles tan rápidamente como la enzima no mutada sintetiza acetolactato o acetohidroxibutirato, además de mantener su estereoespecificidad.
Actividad catalítica secundaria
Algunas de las AHAS presentan una significante reacción oxigenasa secundaria en la que el oxígeno molecular ataca electrofílicamente el carbanión altamente reactivo para formar un aducto peróxido que se descompone en tiamina difosfato y ácido peracético. El ácido peracético puede reaccionar posteriormente con piruvato para dar lugar a dos moléculas de acetato. Esta reacción oxigenasa está parcialmente inhibida por altas concentraciones de los cetoácidos aceptores, pero esta inhibición es saturable, manteniéndose una actividad oxigenasa residual del 10-15%. Por tanto, un mecanismo clásico de Theorell-Chance que involucre la expulsión de dióxido de carbono de forma simultánea con la reacción del aceptor puede ser descartado. Una alternativa es que el oxígeno podría rutas de acceso al sitio activo que son diferentes de las utilizadas por los sustratos aceptores. Recientes resultados con AHAS II han mostrado que hay una ruta adicional para el consumo de oxígeno a través de un ciclo fútil redox en el que el FAD es reducido por la forma reactiva de carbanión y reoxidado por el oxígeno molecular.
No hay comentarios:
Publicar un comentario