Aplicaciones comerciales

Aplicaciones comerciales de la AHAS

Herbicidas inhibidores de la AHAS

Aparte de su importancia para la producción de aminoácidos ramificados, la AHAS es una diana clásica para compuestos comerciales herbicidas. Cinco clases principales de herbicidas que titnen a la AHAS como diana se comercializan en varios países alrededor del mundo: sulfonilaminocarboniltriazolinonas, triazolopirimidinas, ácidos pririmidinilsalicilicos, sulfonilureas y imidazolinonas. La interacción de las sulfonilaminocarboniltriazolinonas con la AHAS a nivel molecular todavía no ha sido estudiada. Los herbicidas inhibidores de la AHAS más populares comercializados actualmente son las sulfonilureas y las imidazolinonas ya que son altamente selectivos, potentes y no tóxicos para los animales. Una de las características más atractivas de las sulfonilureas y las imidazolinonas, es que debido al metabolismo diferencial que sufren en las distintas especies, es posible identificar compuestos que solo determinadas especies de cultivo son capaces de detoxificar. La detoxificación de estos herbicidas en las plantas se puede lograr a través de desalquilaciones, hidroxilación de los anillos, glucoconjugación o rotura de los anillos. Alternativamente, en vez de seleccionar el herbicida que sea detoxoficado específicamente por el cultivo, se ha vuelto popular generar variedades de cultivo resistentes a los herbicidas.

Triazolopirimidinas

Las triazolopirimidinas fueron inventadas a finales de los 80 por Dow Elenco. Las triazolopirimidinas consisten en un anillo aromático di o trisustituido unido por un corto puente a un sistema cíclico de triazolopirimidina. Dos de los grupos del primer anillo (R1 y R2) suelen ser grupos electrofílicos, como Cl o F. Un grupo del anillo de triazolopirimidina (R4) suele ser un grupo apolar como un H, un grupo metoxi o un grupo etoxi. Los otros grupos de la estructura pueden ser grupos tanto polares, como F, como apolares, como grupos metoxi. El anillo aromático puede ser sustituido por un anillo de quinolina, sinque la molécula pierda su capacidad de inhibir a la AHAS. 

Ácidos pirimidinilsalicílicos

Los ácidos pirimidinisalicílicos fueron desarrollados a final de los 80. La estructura general de esta clase de herbicida consiste en un anillo de pirimidina disustituido unido ya sea por un átomo de azufre (ácido pirimidiniltiobenzoico) o por un átomo de oxígeno (ácido pirimidiniloxibenzoico) a un anillo sustituido de benzeno. Los grupos unidos al anillo de pirimidina (R3 y R4) suelen ser grupos metoxi, mientras que de los grupos unidos al anillo de benzeno, uno suele ser un grupo carboxil (R2), mientras que el otro (R1) varía desde un átomo de cloro hasta un gran anillo aromático. La inhibición de la AHAS vegetal por los ácidos pirimidinilsalicílicos es potente y no competitiva respecto al piruvato.

Sulfonilureas

Las sulfonilureas fueron desarrollados al final de los 70 por el Dr. George Levitt. En 1984, después de dos años de la introducción al mercado de la primera sulfonilurea, se determinó que la AHAS era el sitio de acción de la sulfonilurea. Aunque la estructura de las sulfonilureas puede variar considerblemente, la mayoría consisten en un anillo aromático sustituido (R1) unido a, o bien una triazina disustituida, o bien a un anillo de pirimidina a través de un puente de sulfonilurea. El sustituyente del anillo aromático (R1) varía desde ésteres de metil o etil carboxil hasta grupos muchos más grandes como el trifluoropropano, aunque una de las sulfonilureas más potentes solo tiene un átomo de cloro como sustituyente en el anillo aromático. Normalmente, el puente de sulfonilurea no está sustituido en la posición R2. Sin embargo, una ligera elongación del puente por la adición de un grupo metileno o por un átomo de oxígeno adyacentes al grupo sulfonil puede ser tolerada. El heterociclo está normalmente disustituido (R3 y R4) con grupos más pequeños como grupos metoxi o metil. Las sulfonilureas inhiben a la AHAS de manera independiente respecto al tiempo. Se ha descrito que las sulfonilureas son inhibidores mixtos, no competitivos o algo competitivos con respecto al piruvato.

Imidazolinonas

Las imidazolinonas fueron desarrollados a principios de los 80 por el Dr. Marinus Los. Las estructuras de las imidazolinonas son mucho menos variables que las de las sulfonilureas. En general, la mayoría de las imidazolinonas consisten en un anillo de piridina carboxilado, el cual puede no estar sustituido, estar (mono)sustituido o estar disustituido (R1, R2). El anillo de piridina puede ser reemplazado por un anillo de benzeno o un anillo de quinolina. Aunque tanto la configuración S como la R son activas, la configuración R es 10 veces más efectiva. Las imidazolinonas inhiben a la AHAS de manera independiente respecto al tiempo. Se ha descrito que las imidazolinonas son inhibidores mixtos o no competitivos con respecto al piruvato. Estos herbicidas son menos potentes que las sulfonilureas.

Sitio de unión a herbicidas de la AHAS

Las estructuras cristalinas de AHAS en asociación con sulfonilureas e imidazolinonas muestran que ambos tipos de herbicidas se unen a la proteína en un túnel que conduce al sitio activo, de modo que su unión bloquea el acceso del sustrato.

Unión de las sulfonilureas

La constelación de residuos aminoacídicos que forman el sitio de unión para la sulfonilurea es casi idéntica para la AHAS vegetal y para la de levaduras. La sulfonilurea se encuentra en una conformación en la que el anillo aromático presenta una rotación que lo aleja del eje del puente de sulfonilurea de modo que los sustituyentes voluminosos del anillo se alinean de forma paralela con los átomos del puente de sulfonilurea. Con unas pocas excepciones, la mayoría de residuos (Val196, Pro197, Met200, Ala205 y Asp376 en la AHAS vegetal) involucrados en el anclaje del anillo aromático de las sulfonilurea realizan los mismos contactos en la AHAS vegetal y en la AHAS de levadura. En contraste, las interacciones de la Gly121, Phe206, Lys256, Met351, Met570 y Val571 son bastante variables dependiendo de la AHAS y la sulfonilurea asociada. Respecto a estos últimos, excepto la Lys256 que puede presentar un puente de hidrógeno con el átomo de nitrógeno o el de oxígeno del puente de sulfonilurea, los demás residuos se asocian a la sulfonilura por interacciones hidrofóbicas con los sustituyentes de los anillos. La única diferencia sustancial entre la AHAS de levadura y la AHAS de plantas es que la Ser653 se encuentra cercana a la sulfonilurea en A. thaliana formando un puente de hidrógeno con el puente de hidrógeno, mientras que el residuo equivalente en S. cerevisiae, Gly657, se encuentra fuera del sitio de unión al herbicida.

Dos de los residuos más importantes que se unen a las sulfonilureas son Trp574 y Arg377, los cuales juegan un papel fundamental en la catálisis. Se cree que el Trp574 está involucrado en el reconocimiento del segundo sustrato. Se cree que la Arg377 es responsable del reconocimiento de sustrato por la unión al grupo carboxilo de los cetoácidos. Los nitrógenos terminales de esta arginina siempre forman puentes de hidrógeno con uno o más de los átomos de oxígeno del grupo sulfonil, uno de los átomos de nitrógeno del anillo heterocíclico, y si está presente, con el átomo de oxígeno del grupo metoxi del anillo heterocíclico.

Unión de las imidazolinonas

La molécula de imidazolinona se une dentro del canal que conduce al sitio activo en la configuración R y posicionada de forma que el anillo de dihidroimidazolona se dirige directamente a la tiamina difosfato, mientras que el anillo de quinolina sale hacia la superficie de la proteína. Solo el anillo de dihidroimidazolona y parte del anillo de quinolina de la imidazolinona comparten parte del sitiositio de unión de la sulfonilurea. De los 10 residuos involucrados en la unión de la imidazolinona a la proteína, 8 también están involucrados en la unión de las sulfonilureas. Por tanto, es imposible que ambos herbicids se unan e inhiban a la AHAS al mismo tiempo.

La imidazolinona se mantiene en el sitio de unión por 18 interacciones hidrofóbicas y por un puente salino entre el ácido carboxílico sustituyente y uno de los átomos de nitrógeno terminales de la Arg377. El anillo de quinolina se mantiene sujeto por los residuos Met200, Asp376, Arg377. Ser653, y Gly654. Ya que el anillo de quinolina no está presente en todas la imidazolinonas, estas conexiones pueden explicar las diferencias de la potencia de la inhibición entre distintas imidazolinonas. El anillo de dihidroimidazolona interacciona con las Lys256 y Trp574, mientras que los sustituyentes metil e isopropil, requeridos para una alta actividad herbicida, interaccionan con los carbono alfa de Ala122 y con las cadenas laterales de Ala122, Phe206, Gln207, Lys256 y Trp574. Aunque la sustitución del oxígeno exocíclico del anillo dihidroimidazolona es absolutamente necesaria para la actividad herbicida, no realiza ningún contacto con la AHAS.

Mecanismo de inhibición

El mecanismo de acción de los herbicidas no se conoce completamente. La mayoría de los estudios han sugerido que estos herbicidas se unen fuertemente a la enzima después de la formación del intermediario L-ThDP, lo que implica que la inhibición requiere condiciones para que se pueda llevar a cabo la catálisis. Este descubrimiento es consistente con la hipótesis de que el herbicida ocupa el lugar al que el segundo sustrato se une. Sin embargo, a partir de las estructuras cristalinas y diversos estudios, se ha demostrado que las sulfonilureas son capaces de unirse a AHAS e inactivarla en ausencia de sustrato. En un estudio se observó que la tiamina difosfato es absolutamente necesaria para la inhibición por una sulfonilurea de la AHAS II de E. coli. A partir de estas observaciones se sugirió que la inactivación enzimática podría corresponderse a un cambio en la conformación enzimática que desfavorecería la conformación en V de la tiamina difosfato, necesaria para la catálisis.

Además, se sugirió que las diferencia de afinidad entre las AHAS de distintas especies eran la causa de la incompatibilidad entre diversos estudios sobre la irreversibilidad de la inhibición por herbicidas. De hecho, en estudios en los que se verificó la eliminación del inhibidor, se observó que la AHAS bacteriana recuperaba su actividad, mientras que la AHAS de la cebada, la cual tiene una afinidad mucho mayor por la tiamina difosfato, no la recuperaba. Estudios recientes en la AHAS II de E. coli y en la AHAS de levadura han mostrado que durante el curso de la catálisis la tiamina difosfato es lentamente degradada. Además, en la presencia de sulfonilureas este proceso se acelera de algún modo. La mayoría de las estructuras cristalinas de AHAS asociadas con sulfonilureas muestran la tiamina difosfato fragmentada. Aunque en la estructura de la AHAS asociada a imidazolinona presenta la tiamina difosfato con su completa estructura, este ligando está deformado de forma similar a lo que ocurre con las sulfonilureas. Una consecuencia del cambio de conformación de la tiamina difosfato es una perturbación de la geometría de coordinación del ión de magnesio que mantiene anclada a la tiamina difosfato.

Otros inhibidores de la AHAS

Existen otros inhibidores sintéticos y naturales de la AHAS que no son comercializados como herbicidas debido a distintas causas, como ineficiencia debido a una baja absorción por la planta o a una alta tasa de detoxificación. Otra causa es que pueden ser que estos inhibidores también sean tóxicos para animales. Por ejemplo, el acetilfosfinato inhibe la piruvato deshidrogenasa además de la AHAS. Hasta hace unos pocos años, no ha existido mucho interés en desarrollar inhibidores de la AHAS para su uso como agentes antimicrobianos, ya que estos serían capaces de sobrevivir tomando los aminoácidos ramificados del medio.

No obstante, las micobacterias son buenas dianas para la inhibición de la síntesis de los aminoácidos ya que al replicarse dentro de fagocitos como los macrófagos, la disponibilidad de ciertos aminoácidos puede ser limitada. En 1998 se demostró que ciertas sulfonilureas seleccionadas eran efectivas para inhibir el crecimiento de varias cepas de M. tuberculosis.  Las imidazolinonas muestran muy poca actividad o ninguna contra estas bacterias. Aunque la inhibición de estas cepas por sulfonilureas es mucho menos intensa que la llevada a cabo con los compuestos usados actualmente para tratar la enfermedad, su uso puede ser útil para controlar la expansión de esta enfermedad en lugares donde ha desarrollado resistencia a los medicamentos utilizados.

Referencias

McCourt J.A. and Duggleby R.G. (2006) Acetohydroxyacid synthase and its role in the biosynthetic pathway for branched-chain amino acids. Amino Acids. 31:173-210

Regulación

Regulación alostérica de la AHAS

La reacción llevada a cabo por la AHAS es la primera reacción común en la biosíntesis de los tres aminoácidos ramificados en plantas, algas, hongos y bacterias, y por tanto está sometida a retroalimentación negativa por parte productos terminales de la ruta metabólica. En procariotas el efector es normalmente valina, aunque también pueden tener algún efecto la leucina y la isoleucina. Las AHAS de bacterias han sido estudiadas en profundidad, particularmente la de E. coli que codifica para tres isoenzimas diferentes (AHAS I, AHAS II y AHAS III), con diferentes propiedades y respuestas regulatorias. Muchas otras bacterias presentan una única AHAS con una subunidad reguladora similar a la de AHAS III y por tanto un similar modelo de inhibición mixta no cooperativa por valina. La inhibición por valina es un obstáculo en el uso de fermentadores para la sobreproducción de la misma valina o antibióticos que contengan valina. Por tanto, muchas líneas de investigación están interesadas en explotar la manipulación genética para obtener cepas resistentes a la inhibición por valina para evitar este problema. En las enterobacterias codificadoras de las tres isoenzimas se observa una resistencia a esta inhibición por valina ya que la AHAS II no se ve inhibida por este aminoácido. 

AHAS III bacteriana

La inhibición por valina de la AHAS III no es completa y alcanza una saturación al 60-85%. Los estudios cinéticos de esta enzima a distintas concentraciones de piruvato y de valina indican que el modelo de inhibición es mixto no cooperativo, es decir, una inhibición básicamente no competitiva. La localidad del sitio para la valina en AHAS III ha sido estudiada por mutagénesis. La mayoría de las mutaciones espontáneas que confieren resistencia a la inhibición por valina en la AHAS III que han sido descritas son consistentes con el hecho de que la valina establece contactos en el dominio ACT. Estos dominios están presentes en todas las subunidades reguladoras estudiadas están formados por una motivo que adopta una topología beta-alfa-beta-beta-alfa-beta. Posteriormente se han desarrollado mutantes de esta enzima resistentes a valina modificando residuos en este dominio. 

Una observación interesante es que el mutante Thr34Cys tiene poco efecto en la respuesta a valina, mientras que el reemplazo de la treonina por un aminoácido voluminoso incrementa el equilibrio de inhibición unas 50 veces. La treonina 34 no es el lugar en el que se cree que se une la valina, sino que su papel en la inhibición se basa en su involucración en distintos dominios o en las interacciones entre subunidades.

Aunque el sitio de unión a la valina se encuentra en el dominio N-terminal, el dominio C-terminal también se requiere para la inhibición por valina. De este modo, las enzimas mutantes truncadas o con mutaciones puntuales en el dominio C-terminal mantienen su actividad pero pierden completamente la sensibilidad a la valina. No se conoce con certeza qué regiones del dominio C-terminal se requieren para que el péptido confiera sensibilidad a la valina o cómo duncionan los dominios de la subunidad reguladora. Se llevaron a cabo estudios de mutagénesis aleatoria masiva en el dominio C-terminal acoplada a reconstitución in vivo y a la selección para aislar mutantes resistentes a valina. Los mutantes truncados así como un mutante puntual, obtenidos en el experimento sintetizaban una proteína a cuyo dominio ACT no se unía la valina de manera estable. Esto indica que las interacciones del dominio ACT con un dominio C-terminal normal e intacto son necesarias para que el dominio ACT alcance la conformación necesaria con alta afinidad por valina.

AHAS I bacteriana

La subunidad reguladora de la AHAS I es una proteína corta de 96 aminoácidos (aproximadamente la mitad que la subunidad reguladora de AHAS III y otras AHAS bacterianas), la cual parece ser que se pliega para formar único dominio similar al ACT. La AHAS I muestra una respuesta de inhibición ante valina con muy poca actividad residual cuando se alcanza la saturación, lo cual permite encajar esta regulación en el modelo alostérico exclusivo clásico de Monod-Wyman-Changeux (MWC). Este modelo asume la creación de un equilibrio de forma cooperativa de todas las subunidades simultáneamente entre dos estados conformacionales, uno de los cuales tiene alta afinidad por el sustrato y otro de los cuales tiene una alta afinidad por el inhibidor además de excluir al sustrato. Estudios de mutantes han corroborado que el sitio de unión de la valina para esta enzima es también el dominio ATC.

AHAS II bacteriana

La AHAS II no es sensible a la retroregulación negativa por cualquier aminoácido y no muestra sitio de unión a la valina. Un examen de su secuencia muestra que esta no muestra homología estructural con los dominios ATC y que le faltan varios de los elementos de unión a ligando necesarios para la unión del aminoácido. Por ejemplo, la G14 de AHAS III o la G20 de AHAS I son reemplazadas por glutamato, y la N11 de la AHAS III o la N17 de la AHAS I son reemplazadas por una fenilalanina.

AHAS vegetal, de A. thaliana

La subunidad reguladora de la AHAS de plantas es considerablemente más grande que la subunidad reguladora de la AHAS III de E. coli, y por tanto su comportamiento regulador es más complejo. La holoenzima en su conjunto no puede ser aislada directamente de tejido vegetal o de cultivos de tejidos, pero la mezcla de la subunidad catalítica purificada a partir de A. thaliana con su subunidad reguladora obtenida por expresión recombinante permite obtener una holoenzima activa que es sensible a inhibición por valina, leucina e isoleucina. Existe una sinergia entre los efectos de la leucina y la valina en la enzima reconstituida que imita de forma muy cercana la actividad de la enzima en los extractos de muestra vegetal.

La subunidad reguladora contiene una secuencia de aproximadamente 180 residuos y ha sido propuesto que contiene dos dominios correspondientes a dos repeticiones de dominios similares a ACT, que presentan sitios de unión separados para leucina y para valina/isoleucina en la interfaz del dominio. Cuando cualquiera de los sitios se ocupa con un ligando, se produce una señal en un centro común de la subunidad que induce la inhibición de la actividad catalítica. Además, se ha sugerido que otras señales separadas y recíprocas que facilitan la unión del otro regulador cuando uno ya está unido. Las hipótesis sobre este centro común se basan en la observación de que la intensidad de la inhibición es similar cuando solo se une leucina y cuando se une la combinación de leucina y valina.

AHAS de levadura

 Las AHAS de levadura y otros hongos son únicas ya que su inhibición por valina es completamente anulada en presencia de MgATP. MgATP produce una pequeña activación de la enzima incluso en ausencia de valina. La subunidad reguladora de la AHAS fúngica tiene una secuencia conservada de 140-150 aminoácidos, similar a la que se repite en la AHAS vegetal, con un inserto de 38-55 aminoácidos que está parcialmente conservado entre las AHAS de hongos. El comportamiento cinético de la AHAS de levadura podría ser interpretado usando un modelo alostérico clásico, en el que la subunidad reguladora existe en dos conformaciones, H y L. Estas conformaciones están en equilibrio con respecto a la otra. Ambas se unen con la misma afinidad a la subunidad catalítica, pero cual la conformación H está unida a esta subunidad da lugar a una estimulación sustancial (con un factor de 10) de su actividad. Mientras tanto, si es la conformación L la que se une a la subunidad catalítica, produce una pequeña o nula estimulación. El MgATP se une a la conformación H y en condiciones de saturación convertirá todas las subunidades reguladoras a la conformación H. Para la subunidad reguladora no mutada, la constante de equilibrio es de aproximadamente 0,2, por lo que en la ausencia de MgATP la conformación H está favorecida respecto a la L en una relación 5:1, por lo que el efecto del MgATP en la enzima no inhibida es pequeño. La valina se une a la conformación L y por tanto inhibe a la enzima debido a la disminución de la proporción de la conformación H. En presencia de valina, el MgATP tiene una gran actividad al ser capaz de cambiar drásticamente el balance entre H y L hacia la conformación H.

Referencias

Barak, Ze'ev & Chipman, D.M. (2012) Allosteric regulation in Acetohydroxyacid Synthases (AHASs) - Different structures and knietic behaviour in isozymes in the same organisms. Achives of Biochemistry and Biophysics. 519:167-174

Mecanismo de acción

Mecanismo de acción de la AHAS

La mayoría de los datos estructurales y sobre el mecanismo enzimático de AHAS provienen de una sola isoenzima, la AHAS II de E. coli. Es importante señalar que esta enzima tiene varias propiedades atípicas. Sus subunidades reguladoras tienen diferencias importantes en su secuencia en comparación con las otras AHAS, no muestra retroregulación negativa y su subunidad catalítica no es activa por sí sola. La reacción secundaria que la AHAS lleva acabo para la formación de peracetato es al menor un orden de magnitud más rápida en la AHAS II que en la AHAS III.

La tiamina difosfato de la enzima juega un papel central en el mecanismo de acción. Una molécula de piruvato es atacada por el carbanión formado en la tiamina difosfato y sufre la consiguiente descarboxilación. En posteriores pasos, la hidroxietiltiamina difosfato (HEThDP) formada ataca al segundo carbonil sustratro (aceptor) para formar un aducto entre el producto de la catálisis y la tiamina fosfato. En los últimos pasos, el producto se disocia dela tiamina difosfato para separarse en su forma libre. La competición directa entre sustratos aceptores alternativos por la HEThDP formada es lo que determina la relación entre los productos que se forman.

 En todas las enzimas dependientes de tiamina difosato, el cofactor ligado adquiere una conformación en V en el centro activo, dando lugar que el grupo amina del N4' se encuentre muy cercano al C2 del anillo tiazol. Además, el N1' es mantenido cerca de una cadena lateral de un glutamato conservado. Estudios con deuterio en enzimas dependientes de tiamina difosfato revelaron que tasa típica de intercambio protónico en el C2 de la tiamina difosfato se conseguía gracias a la formación de un puente consistente en el glutamato conservado, la porción aminopirimidina y el C2-H. Sin embargo, la mutación del glutamato conservado a glutamina o alanina resultó en una reducción de la tasa de desprotonación del C2 de solo dos órdenes.

Cinética de la enzima

En las enzimas no mutadas, la relación entre productos depende solamente de las cantidades relativas de los aceptores presentes en el medio. La constante catalítica de la enzima es casi independiente de la cantidad o la identidad de los aceptores, lo que indica que está determinada por pasos que preceden al paso de carboligación que determina el producto, de modo que los pasos que contribuyen a la discriminación de los aceptres tienen poco efecto en la tasa general de reacción. 

Los comportamientos cinéticos de varias formas mutantes de AHAS II son completamente diferentes, Por ejemplo, la modificación de la Met260, la Phe109 o la Arg276 dan lugar que la reacción con el sustrato aceptor sea al menos parcialmente determinantes de la tasa de reacción. En las catálisis llevadas a cabo por estos mutantes, la reacción del HEThDP con el carbonil del segundo sustrato, la liberación del producto o ambos procesos son significativamente más lentos que en la enzima no mutada. Esto permite detectar cantidades significantes de intermediarios covalentes en el estado estacionario. 

Intermediarios

Tanto el aducto de la tiamina difosfato con el grupo lactil (LThDP) previo a la descarboxilación del piruvato, como el HEThDP y el acetohidroxiácido producido producido pueden ser detectados cuantitativamente en la mezcla de reacción después de una rápida inactivación de la enzima. La determinación de la distribución de los intermediarios claves por análisis de RMN hace posible calcular las constantes para las tasas unimoleculares de reacción para los pasos individuales de la catálisis.

La tasa de formación para el LThDP, el primer paso detectable, es abrumadoramente determinante para la tasa general de la catálisis, mientras que los pasos posteriores (descarboxilación, carboligación y liberación del producto) tienen unas tasas mucho mayores y parecidas entre sí. Esta diferencia entre las tasas de reacción explican por qué la constante catalítica de la AHAS es esencialmente la misma para la formación de acetolactato o de acetohidroxibutirato, a pesar de que la preferencia de 2-cetobutirato como aceptor es 60 veces mayor que con el piruvato. La existencia de un paso cuya determinación de la velocidad de catálisis sea tan abrumadora es única para la AHAS, ya que en otras enzimas dependientes de tiamina difosfato las energías para todos los estados de transición son similares. El origen molecular para la lenta y determinante tasa de formación del LThDP es un importante puzzle a resolver en el mecanismo de la AHAS.

Sustratos no naturales

La formación determinante de LThDP tiene una interesante consecuencia para reacciones "no naturales" de la AHAS. Tanto la AHAS I como la AHAS II son capaces de catalizar la formación de fenilacetil carbinoles a partir de piruvato y de benzaldehído o sus derivados en competición con la formación de acetolactato y/o acetohidroxibutirato. Muchos mutantes de AHAS que se especializan en la formación de los acetohidroxiácidos frente a la formación de los fenilacetil carbinoles son tanto excelentes herramientas potenciales biosintéticas como fuentes de información para las interacciones enzima-sustrato en estas enzimas. Un grupo de residuos situados en el centro activo, particularmente una arginina, se requieren para una reacción rápida y específica del intermediario HEThDP con piruvato o cetobutirato, pero no con aldehídos aromáticos. Por ejemplo, la mutagénesis de la Arg276 en AHAS II da lugar a una enzima que puede sintetizar fenilacetil carbinoles tan rápidamente como la enzima no mutada sintetiza acetolactato o acetohidroxibutirato, además de mantener su estereoespecificidad.

Actividad catalítica secundaria

Algunas de las AHAS presentan una significante reacción oxigenasa secundaria en la que el oxígeno molecular ataca electrofílicamente el carbanión altamente reactivo para formar un aducto peróxido que se descompone en tiamina difosfato y ácido peracético. El ácido peracético puede reaccionar posteriormente con piruvato para dar lugar a dos moléculas de acetato. Esta reacción oxigenasa está parcialmente inhibida por altas concentraciones de los cetoácidos aceptores, pero esta inhibición es saturable, manteniéndose una actividad oxigenasa residual del 10-15%. Por tanto, un mecanismo clásico de Theorell-Chance que involucre la expulsión de dióxido de carbono de forma simultánea con la reacción del aceptor puede ser descartado. Una alternativa es que el oxígeno podría rutas de acceso al sitio activo que son diferentes de las utilizadas por los sustratos aceptores. Recientes resultados con AHAS II han mostrado que hay una ruta adicional para el consumo de oxígeno a través de un ciclo fútil redox en el que el FAD es reducido por la forma reactiva de carbanión y reoxidado por el oxígeno molecular.

Referencias

Chipman, D.M., Duggleby, R.G. and Tittmann K. (2005) Mechanisms of acetohydroxyacid synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 9:475-481